揭开呼吸链 超级复合物的“庐山真面目”——“2018年北京市科学技术奖”实至名归

杨茂君实验室全体成员合影

杨茂君团队发表在《细胞》杂志网站的照片

猪源呼吸链超级复合物中等分辨率三维结构(局部)

猪源超级复合物的高分辨率结构(局部)

疟原虫Ndh2二聚体的高分辨率三维结构(局部)

人源呼吸链超超级复合物的结构模型(局部)

从基质侧观察的ATP合成酶四聚体的结构(局部)

杨茂君教授很满意自己的微信头像，作为清华大学生命科学学院教授，做线粒体呼吸链研究十余年，他把一张满是中国元素“飞龙”的图片做成头像，图画中奔腾的“二龙”：一条是年画中威武的“中国龙”，另一条“龙”由呼吸链中蛋白质机器的三维图“幻化”而成(左图)。

在接受科技日报记者采访时，杨茂君表示，这张图是发表在国际顶级期刊《细胞》杂志网站首页的照片，它代表着所在团队在生命科学领域取得的一项突破性成果。

呼吸，是生命的体征和原动力，人无时无刻不在呼吸，呼吸作用主要由位于线粒体内膜上的呼吸链超级复合物完成，对线粒体呼吸链的研究一直都是生命科学领域的热点之一。1978年Peter D.Mitchell因提出线粒体呼吸链的化学渗透假说，1997年John E.Walker因阐明三磷酸腺苷(ATP)合成酶的三维结构获得诺贝尔化学奖;日前，William G.Kaelin等科学家因发现了氧气感知通路(生命体对缺氧和富氧做出不同反应的分子机制)获得了2019年诺贝尔生理学或医学奖。

早在2008年刚回国组建实验室时，杨茂君教授就认定了线粒体呼吸链这个研究方向。当时，处于呼吸链上游的超级复合物的结构及功能的研究，在我国还相对比较落后，面对这块难啃的“骨头”，他偶尔也会感叹“前路漫漫”。

经过十年如一日的潜心研究，杨茂君团队在这条探索之路上终于取得了一系列成果：攻克了哺乳动物线粒体呼吸链超级复合物的原子分辨率结构这一难题;首次从体外培养的人源细胞中分离、纯化出高纯度的呼吸链蛋白复合物，并且首次发现并解析了人源超超级复合物I2III2IV2的高分辨率三维结构。相关研究成果“线粒体呼吸链蛋白的结构与功能研究”获得了2018年度北京市科学技术奖二等奖。

首次解析呼吸链超超级复合物高分辨率结构

什么是呼吸链呢?

线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞的“动力车间”，细胞生命活动所需的能量，大约95%来自线粒体。线粒体里面有一层褶皱很多的内膜，内膜上有生产能量的“机器”——蛋白质，这些蛋白质在内膜上完成氧气、电子、质子等物质的“搬运”“安装”等工作，这条产生能量的“流水线”被称为呼吸链。杨茂君教授团队所做的，正是将这些“机器”的“配件”一点点拆解开来，并为其画出精细的结构。

想要研究呼吸链超级复合物的功能，首先要能够看清它的“模样”。前人的研究表明，呼吸作用由位于线粒体内膜上的4种呼吸链蛋白复合物分步完成。这四种蛋白复合物分别为复合物I(NADH脱氢酶)、复合物II(琥珀酸脱氢酶)、复合物III(细胞色素c还原酶)和复合物IV(细胞色素c氧化酶)。

“复合物并不是单独存在，而是以不同的形式组合形成超级复合物，由于目前很多复杂的大分子物质难以获得晶体，X射线晶体学成像便无法获得其高分辨率结构，因此需要借助最新科技成果——冷冻电镜技术来帮忙。”杨茂君教授说道，“通过筛选、添加大量活性小分子化合物，我们开发并优化了蛋白纯化新方法，最终获得了结构稳定、均一性好、纯度较高的猪源线粒体超级复合物，借助单颗粒冷冻电镜技术，解析了超级复合物的结构，整体分辨率达到3.6到4.0埃，可以观测到蛋白质亚基之间复杂而细致的相互作用，并利用此方法获得了人源呼吸链超超级复合物(I2III2IV2，由2个复合物I、1个复合物III的二聚体、2个复合物IV和2个细胞色素c蛋白组成)的高分辨率三维结构。”这是当时世界上所解析的最大、也是最复杂的膜蛋白超级复合物结构，为人类深入理解哺乳动物呼吸链复合物的组织形式、分子机理以及治疗细胞呼吸相关的疾病提供了重要的结构基础。相关研究成果已发表在国际顶级期刊《自然》《细胞》上。

基于获得的高分辨率结构，杨茂君教授提出了全新的电子传递机制，新提出的电子传递模型考虑到了超级复合物的存在形式，整个过程中不会产生超氧自由基，并且具有更高的电子传递效率，从能量转换的角度来说对能量的利用更加高效，从结构上考虑也更加合理。目前，这一理论还处于假设阶段，需要后续更加精细的生物化学实验对其加以验证。

如何利用解析出的蛋白质结构研发靶向药物，治疗呼吸链异常引起的疾病，让科学研究为人类的健康服务也是目前研究的重点。杨茂君教授告诉记者：“由于II型复合物I只存在于低等生物中，所以它被认为是一种很好的对抗病原体的特异性靶标分子。例如，疟疾是受到全球关注的重要公共卫生问题之一，通过筛选，科学家发现存在两种化合物可以与靶蛋白共结晶，而且对细胞毒性较低。其与青蒿素有协同抗疟疾作用，因此具有与青蒿素联合用药发展新的疟疾治疗方法的潜能。该工作为抗疟疾药物研发提供了重要信息，依据该信息的抗疟疾药物也正在研发之中。”

科学研究要不唯书、不唯上、只唯实

认真观察、大胆假设、小心求证是获得原创性突破成果的“三大法宝”。论文发表后，杨茂君教授时常端详这组复合物，复合物I、III、IV像乐高玩具的组件一样被拼插在一起。

“我发现这里空着。”杨茂君教授一边指一边对记者说，复合物III伸出一只“手臂”，“经过亿万年的进化，生物体不可能让另一边这样浪费着，肯定还有没被发现的结构”。

杨茂君教授富有创意地用“中国龙”图案来代替未被揭秘的对称面，这正是发表在《细胞》上的论文配图的由来。

杨茂君教授相信这一研究可以更进一步，但是线索在哪儿?

“对称才是美的，伸出的这边很可能结合着其他的复合物。”杨茂君教授决定重新纯化复合物IV，“拿到密度图之后，我仔细分析了各个亚基的情况，结果发现13个亚基都吻合匹配，只是在原来认为结合另一个复合物IV形成二聚体的界面上出现一团‘不明物体’。通过建立模型，进行匹配，发现那团‘不明物体’是亚基NDUFA4。在以往纯化复合物IV时，亚基NDUFA4由于超强去垢剂的加入而无法稳定结合。”

至此，复合物IV的谜底终于被揭开。“正确的蛋白质结构，能够让我们更加清晰地了解电子传递的路径。在复合物IV的反应中心，氧气生成了水，同时另一部分质子(H+)被直接泵入线粒体膜间隙中留作他用。”杨茂君说，“在漫长的研究过程中，我们每天面对的不是成功的喜悦，而是各种失败，但正是在失败的基础上逐渐发现真相的过程，才最让人兴奋。”

科学家要为人类健康和未来发展思考

对线粒体呼吸作用的研究不仅具有重要的科学意义，而且有助于攻克多种严重的综合性疾病。

“人类线粒体呼吸链系统异常会导致多种疾病，例如，阿尔茨海默综合征、帕金森综合征、多发性硬化等，我们的研究成果为这些疾病提供了一种治疗的可能性，希望我们的研究最终能够被转化成治病救人的药物。”杨茂君教授对记者说道，越深入地了解蛋白质的精细结构，越能够参透生命体的运转。“通过研究，我们可以明确知道哪个原子出了问题，并设计药物有的放矢地干预疾病，以达到治疗效果。”

研究团队目前正在对已经上市的1400多种药物进行分析，发现有56种药物的作用靶点在呼吸链上。

“例如，呋塞米能促进细胞呼吸，提高氧气利用效率，是目前最有效的抗高原反应药物，其作用靶点正是在呼吸链上。病人在服用有些药物后会产生心悸、无力等副作用，这些发现可以帮助科学家改进药物，以消减其副作用。”杨茂君教授表示。

在杨茂君教授内心深处，有一个终极梦想：通过科学研究，实现人体温度的调控，以延长人的寿命。“假如某人患上医学领域某种目前还不能被治愈的疾病，可以选择把他的体温降下来，维持基础代谢，让他进入睡眠状态。过20年，这个病能治了，再让他苏醒，接受更好的治疗。”他对记者说道。

之所以有这样的终极梦想，杨茂君教授表示，并不是天马行空，人体体温热量主要来源于线粒体，实现这个梦想的突破口就在线粒体的研究上。

呼吸是机体最基本的生命活动，最为平常却又十分神秘，揭开呼吸链超级复合物的“庐山真面目”，探索自身生命活动的规律，是人类医药健康发展历史上一个永恒的话题。